Epigallokateşin gallat (EGCG) kateşin grubu maddelere aittir ve yeşil çaydan (Camellia sinesis L. Ktze (Theaceae) elde edilen bir polifenoldür. Kateşin içeriğinin %50’sinden biraz azını oluşturan EGCG’ye ek olarak, yeşil çay epikateşin-3-gallat (ECG), (-)-epigallokateşin (EGC), (-)-epikateşin (EC) ve (+)-kateşin gibi diğer kateşinleri de içerir. EGCG’nin antioksidan ve anti-enflamatuar etkileri ile proliferasyon, farklılaşma ve apoptozis üzerindeki etkileri iyi araştırılmıştır.

Bu çalışma, epigallokateşin gallatın (EGCG) cilt hidrasyonunu hangi mekanizmalarla iyileştirdiğini araştırmaktadır. Bu amaçla, HAS (hyaluronik asit sentaz) ve HYAL (hyaluronidaz) gen ifadesinin yanı sıra anti-oksidatif aktivite ve anti-pigmenter özellikler Western blot analizleri, lusiferaz analizleri, 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) analizleri ve ters transkripsiyon polimeraz reaksiyonu (RT-PCR) analizleri kullanılarak analiz edilmiştir. RT-PCR çalışmaları EGCG’nin doğal nemlendirme faktörü ile ilişkili genler olan filaggrin (FLG), transglutaminaz-1, HAS-1 ve HAS-2’nin ekspresyonunu arttırdığını göstermiştir.

UVB ışınlaması altında HaCaT hücrelerinde HYAL ekspresyonu azalmıştır. Çalışma ayrıca EGCG’nin anti-oksidatif aktivitesini göstermiş ve HaCat hücrelerinde kaspaz-8 ve -3’ü aşağı regüle ederek radikal kaynaklı apoptoza karşı önleyici bir etki göstermiştir. EGCG, melanom hücrelerinde melanin üretimini ve salgılanmasını azaltmıştır.

İnsan cildinin nemi tutma kabiliyeti, kırışıklık oluşumunu bastırdığı için cilt yaşlanma süreciyle bağlantılıdır. Cilt yaşlanması iki mekanizma aracılığıyla gerçekleşir: içsel ve dışsal yaşlanma. İçsel yaşlanma süreci, cilt hücrelerinin proliferatif aktivitesinin azalması ile karakterize edilir ve bu da kolajen ve elastin sentezinin azalmasına bağlı olarak hücresel yaşlanmaya yol açar. Dışsal yaşlanma ise UV radyasyonu, hava kirliliği ve partikül madde gibi dış çevresel uyaranlardan kaynaklanır. Cildin yaşlanması cilt hücrelerinin dehidrasyonuna neden olur. Hyaluronik asit molekülü cilt neminin düzenlenmesinde kilit bir rol oynar. Çalışmalar hyaluronik asidin, hyaluronik asit sentaz genlerini düzenleyerek cilt nemini arttırdığını göstermiştir.

Çalışmalar ayrıca epidermal hyaluronik asidin yara iyileşme sürecinde hücrelerin çoğalmasını ve farklılaşmasını desteklediğini göstermiştir. Doğal nemlendirici faktörler (NMF’ler olarak da bilinir), cildin nem bariyeri üzerinde doğrudan veya dolaylı bir etkiye sahip olan hyaluronik asit ve filaggrinden (FLG) oluşur. NMF’lerin çeşitli bileşenlerinin UV radyasyonu tarafından bozulduğu ve aşağı regüle edildiği varsayılmaktadır. UV radyasyonunun cilt hasarına neden olduğu mekanizma, mitojenle aktive olan protein kinazlar (MAPK’lar), NF-κB (aktive B hücrelerinin nükleer faktörü “kappa-light-chain-enhancer”) ve tümör nekroz faktörü (TNF)-α gibi sinyal yolu bileşenlerini düzenler. Hyaluronidazın (HYAL) hyaluronik asidi hidrolize eden bir enzim olduğu ve hyaluronidaz (HYAL) geninin ifadesinin UV radyasyonundan güçlü bir şekilde etkilendiği de yaygın olarak belgelenmiştir.

Antioksidan sistem cildimizi UV radyasyonundan, sigara dumanından ve oksijen eksikliğinden korur. UV radyasyonu veya oksidatif stresin neden olduğu reaktif oksijen türleri (ROS) cilt yaşlanması, kırışıklık ve pigmentasyonun ilerlemesini yoğunlaştırır. Aşırı ROS üretimi, apoptoz olarak bilinen dahili programlı hücre ölümünü aktive eder. Bu da yaşlanma sürecini ve yaşlılıkla ilişkili hastalıkları yoğunlaştırır. Bu nedenle, sağlıklı bir cilt durumunu korumak veya yaşlanma sürecini durdurmak için, serbest radikalleri ortadan kaldıran antioksidanların alınması önerilir. Melanin, L-tirozinin dönüştürülmesiyle sentezlenir ve aynı zamanda cildi dış strese karşı korur. Bununla birlikte, aşırı melanin üretimi, diğer şeylerin yanı sıra yaşlılık lekelerine neden olabilir.

EGCG’nin NMF’nin sentez aktivitesi üzerindeki etkileri

Altta yatan çalışma, EGCG ile tedavinin filaggrin (FLG), transglutaminaz (TGM)-1 ve hyaluronik asit sentaz (HAS)-1,2 ve 3 gibi NMF senteziyle ilişkili genlerin ekspresyonunu artırdığını göstermiştir. Özellikle, FLG seviyeleri retinol ile tedaviye kıyasla EGCG tarafından önemli ölçüde artırılmıştır. TGM-1, HAS-1 ve HAS-2 seviyeleri de artmıştır; RT-PCR ile elde edilen verilere dayanan bağıl bant yoğunluğu da EGCG ile tedaviden sonra artmıştır. NMF senteziyle ilgili genleri düzenleyen yukarı akış proteinlerini belirlemek için MAPK’ların ve HAS-2’nin protein ifadesi analiz edilmiştir. HAS-2’nin ifadesi 25 µM EGCG ile artmıştır. EGCG ayrıca c-Jun N-terminal kinazlar (JNK), hücre dışı sinyal düzenleyici kinazlar (ERK) ve p38 dahil olmak üzere MAPK’ların ekspresyonunu da artırmıştır. Lusiferaz aktivitesi de AP-1-Luc plazmidi ile ölçülmüştür. AP-1 tarafından etkilenen lusiferaz aktiviteleri EGCG uygulaması ile doza bağlı bir şekilde artmıştır.

EGCG’nin hücre çoğalmasını ne ölçüde desteklediğini araştırmak için HaCaT hücreleri 12 veya 24 saat boyunca EGCG veya retinol ile muamele edilmiştir. EGCG’nin hücre proliferasyonunu retinolden daha fazla teşvik ettiği bulunmuştur. 12 saat sonra, sıfır saate kıyasla proliferasyondaki artış yüzdesi 12,5 µM EGCG için %240 ve 25 µM EGCG için %265 iken retinol için sadece %150 idi. 24 saat sonra, sıfır saate kıyasla proliferasyondaki artış 12,5 µM EGCG için %269, 25 µM EGCG için %310 ve retinol için %208 olmuştur.

EGCG’nin cildin nem tutma yeteneği üzerindeki etkileri

UVB radyasyonuna karşı cildi koruyucu etkisini araştırmak için, EGCG’nin HaCaT hücrelerine karşı sitotoksik etkisi MTT testi ile belirlenmiştir. UVB’ye 30 mJ/cm2 maruz kaldıktan sonra, hücre canlılığı normal gruba kıyasla %68,9 oranında azalmıştır. Buna karşılık, 12,5 µM EGCG hücre canlılığını %72,8 ve 25 µM EGCG %75,9 oranında önemli ölçüde artırmıştır.

Bu da EGCG’nin UVB radyasyonunun neden olduğu hücre hasarını azalttığını göstermiştir. HaCat hücrelerinin nemlendirme kapasitesini araştırmak için, UVB ile indüklenen hücre hasarından sonra RT-PCR ile HYAL geninin ekspresyonu belirlenmiştir. HYAL-2, -3 ve -4’ün ifadesi EGCG grubunda azalmıştır. Özellikle UVB hasarı ile indüklenen koşullar altında EGCG, HYAL-4 ekspresyonunu doza bağlı bir şekilde azaltmıştır.

EGCG’nin anti-oksidatif ve anti-apoptopik etkileri

EGCG’nin 0-25 µM hedef konsantrasyonundaki anti-oksidatif etkisi 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) ve 2,20-azino-bis(3-etilbenzotiyazolin-6-sülfonik asit (ABTS) çalışmaları ile gösterilmiştir. EGCG, DPPH radikallerini 13.04 ± 3.95 µM yarı maksimal inhibitör konsantrasyonda (IC50) önemli ölçüde azaltmıştır.

ABTS çalışmasında, EGCG ABTS’yi net bir şekilde yakalamıştır; IC50 değeri 1.57 ± 0.06 µM olarak hesaplanmıştır. Bu verilere dayanarak, EGCG’nin nitroprussid (SNP) ile indüklenen ROS’a karşı radikal süpürme yeteneği araştırılmıştır. RAW264.7 hücreleri EGCG ile ön işleme tabi tutulmuş ve ardından EGCG’nin hücreler arası ROS seviyelerini ne ölçüde düzenlediğini belirlemek için SNP ve dihidrorhodamin 123 (DHR123) ile muamele edilmiştir.

Hücre içi ROS’un byflusssitometrik analizlerle ölçülmesi, EGCG’nin ROS seviyesini doza bağlı bir şekilde azalttığını göstermiştir. Bu da EGCG’nin sadece hücre dışı değil aynı zamanda hücre içi radikalleri de düzenleyebildiğini doğrulamaktadır. SNP’nin neden olduğu nitrik oksit üretiminin EGCG tarafından azaltılıp azaltılmadığı da araştırılmıştır. EGCG, HaCaT hücrelerinde SNP ile indüklenen nitrik oksit üretimini inhibe etmiştir. Serbest radikaller ve ROS apoptozu indüklediğinden, SNP ile muamele edilen HaCaT hücrelerinin canlılığı eş zamanlı olarak doğrulanmıştır.

Antioksidanların ROS seviyelerini kontrol ederek apoptozu baskıladığı araştırmalarda iyi bir şekilde ortaya konmuştur. EGCG’nin hücre ölümüne karşı ne ölçüde koruma sağladığını belirlemek için apoptotik moleküllerin ifade düzeyleri analiz edilmiştir. Apoptoz sırasında kaspazlar parçalanır ve aktif formlara dönüştürülür. Bölünmüş kaspaz-3 miktarı EGCG tarafından büyük ölçüde azaltılmıştır. Kaspaz-3 ekstrinsik veya intrinsik apoptoz sinyal yolağında ortak bir efektör molekül olarak yer aldığından, çalışmada hangi apoptopik sinyal yolağının EGCG tarafından etkilendiği araştırılmıştır. Kaspaz-9 ve -8’in immünoblotlaması, EGCG’nin sadece bölünmüş kaspaz-8 oluşumunu engellediğini göstermiştir. Bu sonuçlar, EGCG’nin ekstrinsik apoptoz sinyal yolunu inhibe ederek apoptozu önlediğini göstermektedir.

EGCG’nin B16F10 hücrelerinde melanin oluşumunu ve salgılanmasını ne ölçüde düzenlediği de belirlenmiştir. Melanin üretimi α-melanosit uyarıcı hormon (αMSH) ile indüklenmiş ve pozitif kontrol maddesi olarak arbutin kullanılmıştır. 100 μM EGCG, sitotoksik etki olmaksızın melaninin hücre dışı salgılanmasını azaltmıştır. Aynı zamanda hücrelerdeki melanin içeriği de ölçülmüştür. 50 μM EGCG melanin salgılanmasını etkilememesine rağmen, melanin üretimi 50 μM veya daha yüksek konsantrasyonda azalmıştır. Sonuçlar EGCG’nin melanin pigmentasyonunu düzenlediğini göstermektedir.

Altta yatan çalışma, EGCG’nin keratinositlerin nemlendirme kapasitesini artırdığını doğrulamıştır. Bu amaçla, ilk olarak NMF ile ilişkili genlerin (FLG, TGM1, HAS-1, -2 ve -3) mRNA ifadesi analiz edilmiştir. Daha sonra, EGCG’nin sitotoksisite olmaksızın NMF ile ilgili tüm genlerin ekspresyonunu arttırdığı bulunmuştur. Çalışma sonuçları ayrıca EGCG’nin keratinositlerde FLG, TGM1, HAS-1 ve HAS-2’yi yukarı doğru düzenlediğini, böylece epidermisi nemlendirdiğini ve cilt bariyerini güçlendirdiğini göstermektedir.

Hangi proteinlerin NMF’yi düzenlediğini belirlemek için, MAPK’ların ve HAS-2 proteininin seviyeleri immünoblotlama ile belirlenmiştir. EGCG’nin p38, ERK ve JNK fosforilasyonunu retinol (pozitif kontrol maddesi olarak) ile aynı ölçüde artırdığı ve HAS-2’nin 25 µM EGCG ile muamele edilerek yukarı regüle edildiği bulunmuştur. Bu sonuçlar NMF ile ilişkili genlerin MAPK’lar tarafından düzenlendiğini göstermektedir. MAPK’ların transkripsiyon faktörü olan AP-1’in aktivitesi lusiferaz sistemi ile analiz edilmiştir. Burada EGCG’nin AP-1’in aracılık ettiği lusiferaz aktivitesini doza bağlı bir şekilde arttırdığı gösterilmiştir. Altta yatan çalışma böylece MAPK’ların keratinositlerin nemlenmesini düzenlediğini doğrulamıştır.

UV ışınları altında, EGCG hücre hasarını ve HYAL’lerin ekspresyon seviyelerini azaltmıştır. EGCG, HYAL ekspresyon seviyelerini azaltarak ve cilt bariyerinin nemlendirme kapasitesini artırarak epidermiste hyaluronik asidin bozulmasını engellemiştir. EGCG’nin hücre çoğalmasını artırdığı da gözlemlenmiştir. Diğer şeylerin yanı sıra, hücre çoğalması kırışıklık oluşumunu azaltır.

EGCG’nin antioksidan özelliklere sahip olduğu ve keratositleri SNP ve UV radyasyonunun aracılık ettiği radikallerden koruduğu da doğrulanmıştır. EGCG’nin anti-oksidatif aktivitesinden kaynaklanan anti-apoptotik etkileri de araştırılmıştır.

Sonuç

Altta yatan çalışma, EGCG’nin cilt hidrasyonu üzerindeki olumlu etkisi ve nemi tutma kabiliyeti, melanin oluşumunu azaltıcı etkisi, kırışmaya karşı etkisi ve serbest radikal temizleyici özellikleri nedeniyle kozmetik bir aktif bileşen olarak çok uygun olduğu sonucuna varmaktadır.

Altta yatan çalışma:

Kim, E. ve diğerleri: Epigallocatechin Gallate’ın Cilt Koruyucu Etkisi; in: Int. J. Mol. Sci. 2018, 19, 173; doi:10.3390/ijms19010173.