Bu çalışmada, kurutulmuş dut yapraklarının %85’lik etanol ekstraktının melanin biyosentezi üzerindeki etkisi araştırılmıştır. Bu ekstrakt, melanin biyosentezi sürecinde DOPA’yı dopakroma dönüştüren tirozinaz enziminin aktivitesini inhibe etmiştir.

Ekstraksiyondan sonra elde edilen mulberoside F (moracin M-6, 39-di-O-bb-D-gucopyranoside), çalışmada tirozinaz aktivitesi ve melan A hücrelerinin melanin bilgisi üzerinde inhibitör etkiler göstermiştir. Mulberoside F ayrıca çalışmada serbest radikal temizleyici olduğunu kanıtlamıştır, bu özellik anti-oksidatif bir etkiye sahip olarak oto-oksidasyona karşı korumada rol oynayan bir özelliktir. Çalışmanın sonuçları, dut ağacının kurutulmuş yapraklarından elde edilen ekstraktın cilt beyazlatıcı bir ajan olarak kullanılabileceğini göstermektedir.

Fungal tirozinaz analizi

Bir mM test maddesi MeOH : H2 O51 : 1,5 ml L-tirozin (1,5 mM) içinde çözülmüştür. 40 ml L-Dopa (25 mM), 80 ml 67 mM fosfat tamponlu salin (pH 6.8) ve 40 ml aynı tampon çözeltisi veya test numunesi 96 kuyucuklu bir mikrotitre plakasına uygulandı ve ardından 80 ml fungal tirozinaz (60U) ile karıştırıldı. 37°C’de otuz dakikalık bir inkübasyondan sonra reaksiyon karışımındaki dopakrom oranı belirlenmiştir. Optik yoğunluk 490 nm (OD 490) baz alınarak numunenin inhibitör aktivitesi, enzim aktivitesinin %50’sini inhibe eden konsantrasyon (IC 50) olarak belirlenmiştir. Koji asit referans madde olarak kullanılmıştır.

Kültüre edilmiş bir HM3KO melanom hücre hattında tirozinazın incelenmesi

HM3KO hücre hatları %10 fetal buzağı serumu ile desteklenmiş modifiye Eagles ortamında kültüre edilmiştir. Tirozinaz aktivitesi, kültürlenmiş HM3KO melanom hücre homojenatı kullanılarak hafifçe modifiye edilmiş bir Pomerantz yöntemi kullanılarak analiz edilmiştir. Hücre peletleri 0,1 mM sodyum fosfat tamponu (pH 6,8) ile 0,1 mM fenilmetilsülfonilfluorid (PMSF) ve %1 Triton X-100 içeren ultrasonik banyoda kısa bir süre muamele edilmiştir. Buzda bir saatlik inkübasyon süresinden sonra, enzim deneyi için 25 mg çözelti proteini kullanılmıştır.[3H]Bileşiklerin her bir konsantrasyonu 0,1 M sodyum fosfat tamponu (pH 6,8) içinde 0,25 mM tirozin, 5mCi tirozin, 0,25 mM l-3,4-dihidroksifenilalanin (DOPA) ve 0,1 mM PMSF’den oluşan bir reaksiyon karışımının 0,5 ml’sinde 37 °C’de bir saat inkübe edilmiştir.

Burada da numunenin inhibitör aktivitesi, enzim aktivitesinin %50’sini inhibe eden konsantrasyon (IC 50) olarak belirlenmiştir. Koji asit referans madde olarak kullanılmıştır. Dut ağacının kurutulmuş yapraklarından elde edilen ekstraktın %85’i tirozinaz aktivitesini inhibe etmiştir.

Bu çalışmada, kurutulmuş dut yaprağı ekstraktının inhibitör etkilerinin mulberroside F, moracin M-6 ve 39-di-O-b-D-glucopyranoside bileşenlerine atfedilebileceği gösterilmiştir. Depigmentasyon ajanlarını belirlemek için her bir bileşiğin hiperoksit süpürme özellikleri ve tirozinazın dopa-oksidaz aktivitesi üzerindeki inhibitör etkisi analiz edilmiştir.

100mg/ml konsantrasyondaki bir bileşik, fungal tirozinaz dopa-oksidaz aktivitesinde %51,6’lık bir inhibisyon oluşturmuş ve 0,29 mg/ml konsantrasyonda %50 inhibisyon (IC 50) tespit edilmiştir. Bu bileşiğin enzim aktivitesi üzerindeki inhibitör etkisinin kojik asitten yaklaşık 4,5 kat daha güçlü olduğu bulunmuştur.

Altta yatan çalışma ayrıca doğal olarak izole edilen mulberroside F’nin tirozinaz aktivitesi üzerindeki inhibitör etkisinin kojik asitten daha güçlü olduğunu göstermiştir. Dikkat çekici bir şekilde, bileşik sadece tirozinaz aktivitesinin inhibisyonu değil, aynı zamanda hiperoksit süpürücü özellikler de göstermiş ve kültürlenmiş melan A hücrelerinde melanin üretimini inhibe etmiştir.

Sonuç

Altta yatan çalışmanın sonuçları, kurutulmuş dut yaprağı ekstresinin ciltteki hiperpigmentasyonun tedavisinde veya önlenmesinde önemli bir değeri olduğunu desteklemektedir.

Altta yatan çalışma:

Lee, S. H. ve diğerleri: Morus alba Yapraklarından İzole Edilen Mulberroside F Melanin Biyosentezini İnhibe Ediyor; in: Biol. Pharm. Bull. 25(8), 1045-1048 (2002)