Bu çalışmada, alfa-arbutinin (4-hidroksifenil aa-glukopiranozit) melanin üretimi üzerindeki inhibitör etkileri hem kültürlenmiş insan melanom hücrelerinde (HMV-II) hem de kültürlenmiş insan derisinin üç boyutlu bir modelinde araştırılmıştır. Işık emici melanin, tirozinaz molekülünün senteziyle başlayan biyokimyasal melanogenez sürecinde oluşur. Ancak melaninin aşırı üretimi durumunda ciltte hiperpigmentasyon meydana gelebilir ve bu da ciltte karakteristik koyu lekelere ve renk değişimine yol açar.

Tirozinaz, melanin sentezinin ilk iki adımında, tirozinin 3-(3,4-dihidroksifenil)-alanine (DOPA) hidroksilasyonunda ve ardından DOPA’nın dopaquinone’a oksidasyonunda yer alır. Tirozinaz bu nedenle bu süreçte anahtar bir enzim olarak da kabul edilir. Tirozinaz sürecini engellemek ve böylece ciltteki hiperpigmentasyonu ortadan kaldırmak için kozmetikte çeşitli maddeler kullanılmaktadır.

Alfa-arbutin uygulaması, insan melanom hücrelerinde (HMV-II) melanin sentezinin konsantrasyona bağlı olarak inhibisyonuna neden olmuştur. Alfa-arbutin, 1,0 mM’den daha düşük konsantrasyonlarda hücre büyümesini etkilememiştir. 0,5 mM’lık bir konsantrasyonda, hücrelerdeki tirozinaz aktivitesi, muamele edilmemiş hücrelerin %60’ı seviyesine düşerken, tirozinaz mRNA ekspresyonu etkilenmemiştir. Alfa-arbutin ile muamele edilen hücrelerde melanin sentezindeki azalma, hücresel tirozinaz aktivitesinin alfa-arbutin tarafından inhibisyonu ile güçlü bir şekilde ilişkiliydi.

Bu nedenle, alfa-arbutinin melanogenez üzerindeki inhibitör etkilerinin, hücre büyümesinin veya tirozinaz gen ekspresyonunun baskılanmasından değil, melanozomal tirozinaz aktivitesinin doğrudan inhibisyonundan kaynaklanması muhtemeldir.

Alfa-arbutinin kültür insan derisinin üç boyutlu modeli üzerindeki etkileri de araştırılmış ve değerlendirilmiştir. Melanin sentezi üzerindeki inhibitör etki, melaninin kantitatif ölçümleri ve doku pigmentasyonunun makro ve mikroskobik incelemeleri ile doğrulanmıştır.

HMV-II hücrelerinin melanin sentezini test etmek için, 100 mm’lik bir kapta 10 ml besiyeri ile kaplanmış ve ardından 10 gün boyunca büyümelerine izin verilmiştir. Çalışmanın 1, 4 ve 7. günlerinde, ortam farklı konsantrasyonlarda alfa-arbutin içeren taze ortamla değiştirilmiştir.

Melanin içeriğinin belirlenmesi, Hosoi ve arkadaşlarının minimal düzeyde modifiye edilmiş yöntemi kullanılarak ölçülmüştür. [PBS(2)] 100 mm’lik bir kapta büyütülen HMV-II hücreleri Mg21-, Ca21 içermeyen fosfat tamponlu salin ile yıkandı. 0,25 tripsin ile muameleden sonra, hücreler santrifüjleme (10 dakika boyunca 100003 g) yoluyla seçildi ve buz üzerinde 0,5 ml %1 Triton X-100/PBS(2) içinde sonike edildi. Buna karşılık, kültürlenmiş insan derisinin üç boyutlu modeli seçilmiş ve 0,5 ml PBS(2) içinde sonikasyona tabi tutulmuştur. Lizat 100003 g’de 10 dakika santrifüj edilmiş ve pelet daha sonra %0,04 proteinaz K/PBS(2) ile 45°C’de 18 saat inkübe edilmiştir. 100003 g’de 10 dakika santrifüj edildikten sonra, pelet buz üzerinde 0,5 ml %1 Triton X-100/PBS(2) içinde sonikasyona tabi tutulmuştur. Melanin içeriğinin kantitatif ölçümü için, asitte çözünen materyaller %10 trikloroasetik asit kullanılarak peletin çift ekstraksiyonu ile elde edilmiştir.

Bu çökelti daha sonra %100 etanol ile bir kez yıkandı, kurutuldu ve ardından 80 °C’de iki saat inkübe edilerek 1 ml 1 N NaOH-%10 dimetil sülfoksit ile çözüldü. Ek olarak, standart çözelti olarak kullanılan sentetik melanin içeren bir çözelti hazırlanmıştır. Çözeltilerin absorbansı 470 nm’de ölçülmüş ve melanin içeriği mg/106 hücre olarak hesaplanmıştır.

Alfa-arbutin ile muamele edilen hücreler ve hücre çoğalması için belirlenen HMV-II hücreleri (1.03106), farklı konsantrasyonlarda alfa-arbutin içeren 10 ml besiyerinde 6 gün boyunca büyümeye bırakılmış ve besiyeri 3. günde değiştirilmiştir. Hücreler %0,25 tripsin ile muamele edilmiş ve ardından hücre sayısı bir hemositometre kullanılarak belirlenmiştir.

Tirozinazın hücresel aktivitesi, Tomita ve diğerleri tarafından geliştirilen ve substrat olarak L-DOPA kullanan yöntem kullanılarak test edilmiştir. Farklı konsantrasyonlarda alfa-arbutin içeren 100 ml ortamdaki toplam 2,03104 HMV-II hücresi 96 kuyucuklu bir mikrotitre plakaya yerleştirilmiş ve 6 gün boyunca inkübe edilmiştir. 1. ve 4. günlerde ortam taze ortam ile değiştirilmiştir. Alfa-arbutin ile muamele edilen hücreler PBS(2) ile yıkandı ve kuyu başına 100 ml %0,5 Triton-X/PBS(2) ile lize edildi. Lizatlar titreşimle karıştırılmış ve her bir kuyucuğa 50 ml 10 mM L-DOPA eklenmiştir. Üç saat boyunca 37 °C’de inkübasyondan sonra absorbans spektrofotometre kullanılarak 475 nm’de ölçülmüştür.

Çalışmanın sonuçları, alfa-arbutinin kültür insan derisinin üç boyutlu modelinde melanogenezi de etkilediğini göstermektedir. Bu etkinin hücre toksisitesi tespit edilmemiştir. Hidrokinonun melanogenez üzerindeki inhibitör etkileri, melanositlerdeki tirozinaz inhibisyonuna ve melanositlere yönelik hücre toksisitesine bağlanmaktadır. Bununla birlikte, HPLC analizi, kültüre edilmiş insan derisinin üç boyutlu modeline uygulanan alfa-arbutinin %70’inin ortamda tutulmasına rağmen, ekimden sonra hidrokinon tespit edilemediğini göstermiştir. Bu sonuçlar, alfa-arbutinin melanin sentezi üzerindeki inhibitör etkilerinin, alfa-arbutinden salınan hidrokinonun etkilerine atfedilemeyeceğini göstermektedir.

Sonuç

Özetle, altta yatan çalışmaların sonuçları, alfa-arbutinin kozmetik bir cilt aydınlatma ajanı olarak kullanılabilirliğini desteklemektedir.

Altta yatan çalışma:

Sugimoto, K. ve diğerleri: Kültürlenmiş İnsan Melanom Hücrelerinde ve Üç Boyutlu İnsan Derisi Modelinde aa-Arbutinin Melanin Sentezi Üzerindeki İnhibitör Etkileri; in: Biol. Pharm. Bull. 27(4) 510-514 (2004)