Inhibitorische Wirkungen von Alpha-Arbutin auf die Melanin-Synthese

In der zugrundeliegenden Studie wurden die hemmenden Effekte von Alpha-Arbutin (4-Hydroxyphenyl aa-Glucopyranosid) auf die Produktion von Melanin sowohl in kultivierten menschlichen Melanom-Zellen (HMV-II) als auch im dreidimensionalen Modell kultivierter menschlicher Haut untersucht. Das lichtabsorbierende Melanin wird im biochemischen Prozess der Melanogenese gebildet; dieser beginnt mit der Synthese des Moleküls Tyrosinase. Kommt es jedoch zu einer Überproduktion von Melanin, kann sich eine Hyperpigmentierung der Haut einstellen, welche zu charakteristischen dunklen Flecken und Färbungen auf der Haut führt.

Tyrosinase ist an den ersten zwei Schritten der Melanin-Synthese beteiligt, der Hydroxylation von Tyrosin zu 3-(3,4-dihydroxyphenyl)-Alanin (DOPA) sowie der nachfolgenden Oxidation von DOPA zu Dopaquinon. Daher wird Tyrosinase auch als ein Schlüsselenyzm dieses Prozesses betrachtet. In der Kosmetik werden verschiedene Stoffe eingesetzt, welche den Prozess der Tyrosinase hemmen sollen und somit Hyperpigmentierungen der Haut beseitigen.

Die Anwendung von Alpha-Arbutin bewirkte eine konzentrationsabhängige Hemmung der Melanin-Synthese in menschlichen Melanomzellen (HMV-II). Bei Konzentrationen, welche geringer als 1,0 mM waren wurde das Zellwachstum durch Alpha-Arbutin nicht beeinflusst. Bei einer Konzentration von 0,5 mM wurde die Aktivität der Tyrosinase innerhalb der Zellen auf das Level von 60% der unbehandelten Zellen verringert, wohingegen die Expression der Tyrosinase-mRNA unbeeinflusst blieb. Die Abnahme der Melanin-Synthese in den mit Alpha-Arbutin behandelten Zellen korrelierte stark mit der Hemmung der zellulären Tyrosinase-Aktivität durch Alpha-Arbutin.

Aufgrundessen liegt es nahe, dass die hemmenden Wirkungen von Alpha-Arbutin auf die Melanogenese von der direkten IHemmung der melanosomalen Tyrosinase-Aktivität verursacht wird und nicht von der Unterdrückung des Zellwachstums oder der Genexpression der Tyrosinase.

Ebenso wurden die Effekte von Alpha-Arbutin auf das dreidimensionale Modell kultivierter menschlicher Haut untersucht und bewertet. Die hemmende Wirkung auf die Melanin-Synthese wurde durch quantitive Messungen des Melanins sowie durch makro- und mikroskopische Untersuchungen der Gewebepigmentierung bestätigt.

Zur Prüfung der Melanin-Synthese der HMV-II-Zellen wurden diese mit 10 ml Medium in einer 100 mm-Schale beschichtet und anschließend 10 Tage wachsen gelassen. An Tag 1, 4 und 7 der Studie wurde das Medium durch frisches Medium, welches unterschiedliche Konzentrationen von Alpha-Arbutin enthielt, ersetzt.

Die Bestimmung des Melaningehaltes wurde gemessen mittels der Methode von Hosoi und anderen, welche minimal modifiziert wurde. In einer 100 mm-Schale gewachsene HMV-II-Zellen wurden mit Mg21-, Ca21-freier phosphat-gepufferten Kochsalzlösung [PBS(2)] gewaschen. Nach einer Behandlung mit 0,25% Trypsin wurden die Zellen via Zentrifugation (100003 g für 10 min) selektiert und in 0,5 ml 1% Triton X-100/PBS(2) auf Eis beschallt. Das dreidimensionale Modell kultivierter menschlicher Haut hingegen wurde selektiert und in 0,5 ml PBS(2) beschallt. Das Lysat wurde für 10 Minuten bei 100003 g zentrifugiert und das Pellet wurde anschließend für 18 Stunden mit 0,04% Proteinase K/PBS(2) bei 45 °C inkubiert. Nach einer Zentrifugation für 10 Minuten bei 100003 g wurde das Pellet in 0.5 ml 1% Triton X-100/PBS(2) auf Eis beschallt. Zur quantitativen Messung des Melaningehaltes wurden durch zweifache Extraktion des Pellets mittels 10%iger Trichloressigsäure säure-lösliche Materialen gewonnen.

Dieses Präzipitat wurde daraufhin einmal mit 100% Ethanol gewaschen, getrocknet und dann mittels zweistündiger Inkubation bei 80 °C mit 1 ml 1 N NaOH–10% Dimethyl-Sulfoxid gelöst. Zudem wurde eine Lösung mit synthetischem Melanin erstellt, welche als Standardlösung diente. Der Absorptionsgrad der Lösungen wurde bei 470 nm gemessen und der Melaningehalt mit mg/106 Zellen berechnet.

Mit Alpha-Arbutin behandelte Zellen sowie zur Zellproliferation determinierte HMV-II-Zellen (1.03106) wurden für 6 Tage in 10 ml Medium, welches unterschiedliche Konzentrationen von Alpha-Arbutin enthielt, wachsen gelassen, wobei das Medium an Tag 3 gewechselt wurde. Die Zellen wurden mit 0,25% Trypsin behandelt und die Anzahl der Zellen danach mit einem Hemocytometer ermittelt.

Die zelluläre Aktivität der Tyrosinase wurde geprüft mithilfe der von Tomita und anderen entwickelten Methode, welche L-DOPA als Substrat nutzt. Insgesamt 2.03104 HMV-II-Zellen in 100 ml Medium, welches unterschiedliche Konzentrationen von Alpha-Arbutin enthielt, wurden auf einer Mikrotiterplatte mit 96 Schächten aufgebracht und für 6 Tage inkubiert. An Tag 1 und Tag 4 wurde das Medium durch frisches Medium ersetzt. Die mit Alpha-Arbutin behandelten Zellen wurden mit der Substanz PBS(2) gewaschen und mit 100 ml 0.5% Triton-X/PBS(2) pro Schacht lysiert. Die Lysate wurden durch Vibration gemischt und 50 ml 10 mM L-DOPA wurden jedem Schacht hinzugefügt. Nach einer dreistündigen Inkubation bei 37 °C wurde mit einem Spektrophotometer der Absorptionsgrad bei 475 nm gemessen.

Die Ergebnisse der Studie legen nahe, dass Alpha-Arbutin im dreidimensionalen Modell kultivierter menschlicher Haut ebenso die Melanogenese beinflusst. Eine Zelltoxizität dieses Effekts wurde nicht festgestellt. Die hemmenden Effekte von Hydroquinon auf die Melanogenese werden auf die Hemmung der Tyrosinase in den Melanocyten und dessen Zelltoxizität gegenüber Melanocyten zurückgeführt. Die Analyse des HPLC zeigte jedoch, dass zwar 70% des Alpha-Arbutins, welches auf das dreidimensionalen Modell kultivierter menschlicher Haut angewendet worden sind, im Medium erhalten blieb, jedoch nach der Kultivierung keinerlei Hydroquinon festgestellt werden konnte. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die hemmenden Wirkungen von Alpha-Arbutin auf die Melanin-Synthese sich nicht auf die Effekte von Hydroquinon, welches vom Alpha-Arbutin freigesetzt worden ist, zurückführen lassen.

Fazit  

Zusammengefasst untermauern die Ergebnisse dier zugrundeliegen Studien die Verwendbarkeit von Alpha-Arbutin als Mittel zur kosmetischen Hautaufhellung.

Zugrundeliegende Studie:

Sugimoto, K. et al.: Inhibitory Effects of aa-Arbutin on Melanin Synthesis in Cultured Human Melanoma Cells and a Three-Dimensional Human Skin Model; in: Biol. Pharm. Bull. 27(4) 510—514 (2004)